L’inizio della costruzione si fa risalire al 1257, a seguito di una richiesta avanzata pochi anni prima dal rettore dello Spedale, Ranieri di Caccianeve, il quale intendeva dotare il Santa Maria della Scala di un oratorio e di un sacerdote, proprio nel momento in cui l’istituzione stava accelerando la propria espansione. Il complesso si andava infatti suddividendo in "specializzazioni funzionali" e i vari "corpi di fabbrica" venivano quindi destinati alle numerose attività svolte all’interno dello Spedale. Il nucleo della chiesa — completamente trasformato nella seconda metà del Quattrocento — corrispondeva in larga parte all’attuale zona centrale della facciata su piazza del Duomo, tuttora riconoscibile dai grandi conci di travertino. Vi si pose mano durante il rettorato di Niccolò di Gregorio Ricoveri (1467), dando corso ad un progetto di Guidoccio di Andrea dell’anno precedente. L’intervento strutturale prevedeva l’inglobamento della "casa delle balie", la creazione di un’unica grande navata, rialzata nella zona absidale attraverso un’ampia scalinata, e l’innalzamento delle pareti laterali fino alla quota della merlatura del contiguo Palazzo del Rettore. La chiesa veniva così a porsi sulla piazza del Duomo come "una cerniera fra il nucleo dello Spedale vero e proprio e lo spazio esterno, punto di transito e di riunione dei cittadini" (D. Gallavotti). La "nuova" chiesa dell’Annunziata vide al lavoro anche il celebre artista senese Francesco di Giorgio con la decorazione della "nobil tribuna" (la zona absidale), nella quale prima della ristrutturazione settecentesca era raffigurata l’Incoronazione della Vergine , e con la pittura del "palcho" a "scatole" (i riquadri del soffitto a cassettoni). Negli ultimi decenni del Seicento, dando corso alle disposizioni testamentarie di Agostino Chigi, già rettore del Santa Maria, venne ricostruito l’altare maggiore e realizzati due altari laterali. Il primo vide l’intervento di Giuseppe Mazzuoli, scultore senese operante a Roma nell’ambiente della famiglia Chigi e i secondi vennero invece completati con due tele dei pittori Pietro Locatelli (Assunzione) e Giovanni Maria Morandi (Annunciazione). Gli altri due altari, sempre dello stesso periodo, ospitano una tela di Ciro Ferri raffigurante la Visione di Santa Teresa e un bel Crocifisso del secolo XIV, collocato al posto di una Santa Francesca Romana realizzata dal pittore Antonio Nasini, purtroppo però perduta durante un incendio e sostituita con la tavola suddetta alla metà del secolo scorso. Al centro dell’altare maggiore, ai lati del Cristo, sono posti inoltre due angeli reggicandelabro in bronzo dell’orafo e scultore cinquecentesco Accursio Baldi, due angeli adoranti e altri due reggicandelabro, in marmo, da riferire sempre alla bottega dei Mazzuoli, così come il bel Cristo Deposto collocato sul fronte, probabilmente opera dello stesso Giuseppe. Con i lasciti del rettore Antonio Ugolini Billò, nel 1730 fu deciso invece di decorare la grande abside della chiesa, commissionando un affresco a Sebastiano Conca, pittore di consolidata fama, particolarmente attivo a Roma. Il dipinto, raffigurante la Probatica Piscina, illustra puntualmente un passo del Vangelo di San Giovanni nel quale gli infermi sostano vicino alla vasca in attesa di una miracolosa guarigione. L’affresco, di grande effetto scenografico, costituisce una delle ultime importanti opere commissionate dal Santa Maria della Scala, alla quale vennero tra l’altro tributati unanimi consensi. Degli inizi del Cinquecento (1518) è invece il grande organo (lato destro) caratterizzato da un elegante intagli e da una raffinata e complessa decorazione, opera del celebre Giovanni di maestro Antonio "piffaro". L’autore nella parte meccanica di questa "macchina" realizzò, negli stessi anni, anche l’organo del Palazzo Pubblico e il nucleo originale di quello della chiesa di Sant’Agostino. Proprio di fronte all’organo è posta la "Cappella della Musica", opera in legno intagliato, tornito e dorato. Questo spazio, riservato ai cantori, realizzato nella prima metà del Seicento, è formato da una piccola abside tripartita da fasce e lesene dorate, da una fitta decorazione vegetale stilizzata e da alcune specchiature ovali con simboli musicali. Sul fianco sinistro (lato destro della porta di ingresso), è posta un’acquasantiera quattocentesca (1453), opera di Urbano e Bartolomeo da Cortona, mentre a metà della navata, sui due lati, entro nicchie di pietra, sono poste le figure di un Angelo Annunciante e della Madonna Annunciata. Le due statue sono sistemate l’una di fronte all’altra. La datazione delle figure è ancora oggetto di approfondimento da parte di alcuni studiosi, anche se appaiono fondate le ipotesi di Enzo Carli che assegna la testa dell’angelo al XIV secolo e quelle di Daniela Gallavotti che riferiscono invece al Cinquecento il corpo dello stesso e al secolo successivo la figura della Madonna.

Spedale di Santa Maria della Scala